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★ 動(dòng)物園禽源奇異變形桿菌對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥分子機(jī)制

梁玉蕾1#，李垠樹1#，陳秋如1，董焱斌1，丁愛萍2*，苑  麗1*

（1.  河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州，450002；2.鄭州市動(dòng)物園，鄭州，450008）

論文摘要

為研究觀賞禽類中分離的奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制，于2019年從河南省某動(dòng)物園禽類養(yǎng)殖區(qū)綠孔雀（Pavo muticus）、紅綠金剛鸚鵡（Ara chloroptera）、火雞（Meleagris gallopavo）、帽子雞（Polish chicken）和非洲鴕鳥（Struthio camelus）5種觀賞禽類中分離17株奇異變形桿菌，經(jīng)藥物敏感性試驗(yàn)、blaCTX-M基因檢測、全基因組測序、PFGE和RT-qPCR等探明受試菌對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共有6株受試菌對(duì)第三代頭孢菌素耐藥，除1株（6D）攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶blaCTX-M-14和1株（106A）攜帶AmpC酶blaACT-16外，其余4株經(jīng)PFGE測證實(shí)為同一克隆型，且細(xì)菌體內(nèi)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxAR、BaeSR和EnvZ/OmpR的表達(dá)量顯著高于敏感菌，主要通過抑制耐藥菌細(xì)胞膜上OmpC和OmpF的表達(dá)減少藥物吸收；同時(shí)促進(jìn)OmpW表達(dá)加速藥物外排，從而減少菌體內(nèi)藥物濃度，進(jìn)而導(dǎo)致其對(duì)第三代頭孢菌素類耐藥。研究表明，動(dòng)物園禽類養(yǎng)殖區(qū)的奇異變形桿菌對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，散播機(jī)制主要為染色體介導(dǎo)的克隆傳播，應(yīng)引起重視。

論文速覽

奇異變形桿菌(P.mirabilis，PM)是公認(rèn)的導(dǎo)致人類和動(dòng)物感染的主要病原體之一。近年來，人源和動(dòng)物源奇異變形桿菌的臨床分離率日趨增多，且多呈現(xiàn)明顯耐藥。β-內(nèi)酰胺類為人醫(yī)和獸醫(yī)臨床常用抗生素，但是，隨著近年來第三代頭孢菌素類藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用，耐藥菌逐漸增多。細(xì)菌中的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal transduction system，TCS）可調(diào)控多種基因（如細(xì)菌細(xì)胞膜上的膜孔蛋白或外排泵相關(guān)基因）的表達(dá)，從而參與細(xì)菌耐藥性的形成。

動(dòng)物園作為人與動(dòng)物進(jìn)行密切接觸和互動(dòng)的重要場所，游客與動(dòng)物互動(dòng)（如接觸或喂食）在教育和娛樂方面有一定價(jià)值，同時(shí)也可能增加病原菌或耐藥菌的散播，但是，截至目前相關(guān)研究較少。本研究從河南省某動(dòng)物園的禽類養(yǎng)殖區(qū)分離獲得17株禽源奇異變形桿菌，經(jīng)藥物敏感性試驗(yàn)、耐藥基因檢測、全基因組測序、PFGE和RT-qPCR研究受試菌對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制和散播機(jī)制，為臨床控制第三代頭孢菌素耐藥菌的傳播提供部分參考依據(jù)，并為評(píng)估動(dòng)物園禽類散養(yǎng)場中人獸共患耐藥菌在人與動(dòng)物間的水平傳播風(fēng)險(xiǎn)提供理論支撐。

2019年7月，在河南省某動(dòng)物園禽類養(yǎng)殖區(qū)，采集綠孔雀（Pavo muticus）、紅綠金剛鸚鵡（Ara chloroptera）、火雞（Meleagris gallopavo）、帽子雞(Polish chicken)和非洲鴕鳥（Struthio camelus）5種觀賞禽類樣品。經(jīng)常規(guī)分離、純化及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，共獲得17株禽源奇異變形桿菌，其中對(duì)多西環(huán)素和恩諾沙星的耐藥率高達(dá)88.2%（15/17）；對(duì)頭孢噻肟和頭孢噻呋的耐藥率為35.3%（6/17）、對(duì)氟苯尼考的耐藥率為23.5%（4/17）；對(duì)阿米卡星耐藥率較低，僅1株（22B）呈現(xiàn)耐藥。

● 17株奇異變形桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用PCR檢測blaCTX-M基因攜帶情況，經(jīng)測序和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，6株耐藥菌株中僅有1株（6D）為blaCTX-M陽性，其亞型為blaCTX-M-14，說明該動(dòng)物園禽類散養(yǎng)場中禽源奇異變形桿菌對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的原因復(fù)雜多樣，需進(jìn)一步研究。

● 6株奇異變形桿菌blaCTX-M基因擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)上述5株耐第三代頭孢菌素但不攜帶blaCTX-M基因的禽源奇異變形桿菌進(jìn)行PFGE分型。菌株17B、21A、25B和29B2具有完全相同的譜型，表明為同一克隆型，且這4株菌分別來自不同禽類樣本，說明該動(dòng)物園禽類散養(yǎng)場內(nèi)對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的禽源奇異變形桿菌存在明顯的克隆散播。

●  5株奇異變形桿菌的PFGE分型圖譜

為進(jìn)一步研究不攜帶blaCTX-M但對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的禽源奇異變形桿菌的耐藥機(jī)制，選取17B和106A進(jìn)行全基因組測序，將獲得的序列數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、組裝和比對(duì)后發(fā)現(xiàn)耐藥菌106A除攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaACT-16外，還同時(shí)攜帶多個(gè)耐藥基因，包括sul1、dfrA14、dfrA27、aph(3')-Ia、aph(6)-Id、aph(3'')-Ib、aac(3)-IId、aadA16、mph(A)、qnrB6、qnrB91、aac(6')-Ib-cr、tet(J)、tet(A)、cat、floR，其中，blaACT-16屬于AmpC酶。AmpC酶能水解多數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán)致使細(xì)菌耐藥，說明菌株106A對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的原因是其產(chǎn)生了AmpC型blaACT-16酶。耐藥菌株17B雖然對(duì)頭孢噻肟耐藥，但未檢測到對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的相關(guān)已知基因，暗示其可能通過其他機(jī)制，如外排泵、膜通透性改變等導(dǎo)致對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥，耐藥機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

任選1株對(duì)頭孢噻肟敏感的禽源奇異變形桿菌12B作為對(duì)照株，采用RT-qPCR檢測耐藥菌株17B的染色體編碼膜孔蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量，菌株17B的ompC和ompF的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低，其中ompC的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照菌12B下降了約93.4%；而ompA和ompW的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高。

● 耐藥菌17B的膜孔蛋白基因相對(duì)mRNA表達(dá)水平

同上，為探究引起外膜蛋白表達(dá)量變化的原因，以敏感菌株12B為對(duì)照菌，采用RT-qPCR檢測耐藥菌株17B的相關(guān)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)基因（cpxA、cpxR、baeS、baeR、envZ和ompR）的相對(duì)表達(dá)水平。與對(duì)照菌12B相比，耐藥菌17B的cpxA和cpxR的相對(duì)表達(dá)量分別增加5倍和4倍，而baeS、baeR和envZ、ompR的相對(duì)表達(dá)量均增加2倍左右。本試驗(yàn)結(jié)果表明，耐藥菌17B的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxAR、BaeSR和EnvZ/OmpR的表達(dá)量顯著高于敏感對(duì)照菌，其抑制OmpC和OmpF表達(dá)而減少藥物吸收，促進(jìn)OmpW表達(dá)而加速藥物外排，減少耐藥菌體內(nèi)的藥物濃度，進(jìn)而對(duì)第三代頭孢菌素類藥物產(chǎn)生耐藥。

● 17B中雙組分系統(tǒng)相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

本研究發(fā)現(xiàn)，分離自不同品種禽類樣本的第三代頭孢菌素耐藥菌（17B、21A、25B和29B2）具有相同的譜型，表明該動(dòng)物園禽類散養(yǎng)場對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的奇異變形桿菌存在著克隆傳播，為控制該克隆傳播，禽類散養(yǎng)場應(yīng)在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理的同時(shí)，嚴(yán)格消毒措施。盡管本研究檢出的克隆傳播菌株未攜帶CTX-M酶，但其仍對(duì)第三代頭孢菌素耐藥，如不能嚴(yán)格消毒，阻斷耐藥菌的克隆傳播，不僅會(huì)造成在禽類散養(yǎng)場區(qū)域內(nèi)流行散播，而且可能通過與游客的互動(dòng)等直接或間接的接觸造成更大范圍的流行散播，故應(yīng)引起人們的足夠重視。

● 基金項(xiàng)目：河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目（23IRTSTHN021）；河南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（232300421111）

● 第一作者簡介：梁玉蕾（1999—），女，碩士研究生；主要從事細(xì)菌耐藥性的研究。E-mail: 2663578845@qq.com

● #共同第一作者：梁玉蕾；李垠樹

● *通信作者：丁愛萍，E-mail: 3190593871@qq.com；苑麗，E-mail: yuanli-hn@163.com